检测蔬菜细胞中ATP含量且无损的方法

ATP是三磷酸腺苷的英文简称，它不仅能储备能量而且可作为生命活动的直接能源物质，ATP含量反映了细胞的活性水平，而近红外光谱技术测定蔬菜细胞ATP含量具有速度快、效率高、成本低、对细胞无损等优势，以下是测试步骤：

第一步：实验材料的准备

研究选用从市场购得的叶类蔬菜菠菜为试验材料。样品置于丙烯酸室内，在恒温培养箱内保存。恒温箱设定温度为25℃，贮藏时间为5天。实验期间，恒温箱每天定时通风一次。每24小时定时取样一次，选取完整叶片3～4片。

第二步：仪器与光谱数据采集

采用近红外分光光度计获取菠菜叶片样本的光谱数据，其波长范围为240～2400nm。选取叶片上4个点，分别测定各点的光谱数据。用分光光度计附带的软件系统分析获得测定叶片的光谱反射率，并计算其平均值。

第三步：叶片原生质体的制备

取经光谱数据测定后的相同菠菜叶片，无菌水洗涤4～5次，用镊子剥去叶片的表皮。将去除表皮的叶片切成0.5～1cm大小的薄片后，置于酶溶液中浸泡，并放置于25℃的恒温培养箱内酶解3小时。用孔径为70μm的尼龙网过滤除去未完全消化的残渣。在900r.min-1条件下离心2min，弃上清。加入3～4mL0.5molL-1甘露醇洗液，相同条件下离心2min，弃上清，留1mL洗液。重复以上离心清洗3次，获得含有活力强且状态好的原生质体悬浮液。

第四步：细胞原生质体ATP含量的生物发光测定

采用萤火虫荧光素酶生物发光技术测定上一步骤制备的细胞原生质体的ATP含量。为准确获得原生质体的平均ATP含量，首先取原生质体悬浮液2μL，用显微数码摄像机对悬浮液中原生质体数量进行计数。然后根据悬浮液中细胞原生质体的数量，选择一定的稀释比例制备测试样品。用萤火虫荧光素酶的检测试剂盒和光度计测量仪测定相对发光量RLU并计算总ATP含量。根据悬浮液中细胞原生质体的计数结果，获得悬浮液中单个细胞原生质体的平均ATP含量。

第五步：数据分析、预测模型的建立与评价

用数据处理软件对获得的光谱数据和细胞原生质ATP含量进行分析，采用相关系数评价相关程度，确定预测原生质体ATP含量的最优特征波长。在此基础上，将实验数据平均分割成建模数据集和验证数据集两个部分。前者用于建立基于最优特征波长光谱数据的细胞原生质ATP含量预测模型，后者用于对所建模型的预测效果进行验证和评价。

通过以上步骤，用近红外光谱仪就可以无损地检测出蔬菜细胞中ATP的百分含量，这也是目前生物实验室最常用最标准的检测方法。